对于原位组织工程（TE）的应用，植入物的降解与新组织的形成同步进行是很重要的，以避免移植物的失败。因此，有一种成像造影剂（CA）将是有价值的。为此，本文提出了一种可生物降解的不透放射性生物材料，由一种双尿素链延伸聚己内酯（PCL-U4U）弹性体和一种新型碘化双尿素改性CA添加剂（I-U4U）组成。各组分之间的超分子氢键相互作用确保了它们的亲密混合。采用含PCL-20-U4U和I-U4U的溶液制备多孔种植体te移植物。大鼠接受主动脉间置移植，要么由PCL-U4U（对照）组成，或由PCL-U4U和I-U4U（试验）组成。在1个月的三个时间点移植移植物进行分析。实验组种植体在移植前的计算机断层扫描成像显示，碘化物的体积和密度随着时间的推移而减少。外植体分析也表明支架已降解。（免疫学）组织化学结果显示，试验组和对照组具有相似的细胞含量和相似的新组织形成过程，表明CA没有明显的不良反应。因此，一种创建固体不透光生物材料的超分子方法可以用于无创地监测合成植入物的生物降解。
一、介绍
原位组织工程（TE）是一种很有前途的治疗心血管疾病的新选择，并已被建议克服目前使用的假体的缺点。在这种TE方法中，植入一种无细胞可降解支架，并打算在体内进行细胞再生。细胞在植入部位分化，随后在体内形成新组织。当新组织形成时，支架会降解，最终会保留一种天然的自体替代物。原位心血管TE方法对支架植入物的性能有很高的要求。该支架应该是一种高多孔、非血栓形成和可生物降解的基质，以便为细胞粘附、细胞分化和组织生成提供一个D模板。
最初，心血管植入物应该能够承受放置在其上的所有机械负荷和应变，随着时间的推移，支架应该安全的降解和消失。支架的及时和可控的降解是原位TE的关键因素，因为必须在体内组织形成和支架降解之间保持平衡。如果支架在形成足够的负重组织之前降解，支架植入失败会造成灾难性的后果。因此，能够在原位进行无创成像和监测植入生物材料的降解将是有价值的。为此，需要一个成像CA，可以作为一个整体来报告（降解）植入物的状态和命运，而不仅仅是CA本身。
目前，TE中无创成像的范围主要集中在追踪细胞、表征组织反应和监测植入物的功能或通畅程度上。只有有限数量的报告显示了适合原位心血管TE的固体有机材料植入物降解的直接体内可视化。此外，在其他研究中，研究了用超小超顺磁氧化铁（USPIO）纳米颗粒标记的胶原支架，并在皮下植入，和聚（偏氟乙烯）（PVDF）基纺织纤维结合USPIOs后，通过手术植入绵羊作为动静脉分流器。
这两种系统都可以用MRI成像，但对于胶原支架，没有观察到降解，而对于PVDF-USPIO支架，预计没有降解，因为PVDF是不可生物降解的。各种研究人员已经成功成像体内降解聚酯、聚氨酯尿素，或胶原支架植入材料，主要使用超声弹性成像（UEI），也有超声横波成像（USWI）、光声成像和显微镜（PAI和PAM）和近红外荧光（NIRF）成像。所有这些技术都很有价值，但也有缺点。例如，UEI成像要求物理压缩可以很容易地应用于感兴趣的区域，而NIRF成像的穿透深度有限。
在本研究中，我们选择了广泛应用的计算机断层扫描（CT）作为监测种植体退化的无创成像技术。CT造影剂（CAs）总是基于高z（重）元素，如碘或钡，在临床上常用。水溶性碘化钙应用血管内获得动脉和静脉血管造影，也油基钙（如碘油），但这两类CA都适合监测植入体内降解，这两种类型的CA可能给一个快速泄漏的生物材料植入。
各种用于各种用途的不透光聚合物ca已经被开发和报道。例如，高度不透光的盐或元素可以与聚合物混合，但这种方法的缺点是材料变得不均匀，可能导致力学性能恶化。此外，大多数不透射线的盐或元素不会生物降解，并在植入后留在体内，从而有效地报告它们的位置，但不报告植入物的命运或状态。
在其他方法中，碘原子共价附着在聚合物链上，例如通过开发不透光的单体或通过对制备的聚合物进行盖层或后修饰。报告材料包括，聚醚聚氨酯，聚（冰毒）丙烯酸酯，生物可降解聚碳酸酯，聚酸酐，聚酯水凝胶，和聚（酯氨酯）阿尔登霍夫等报道，4碘苯甲酸CA组，他们纳入聚甲基丙烯酸酯是稳定除了暴露在γ辐照。在7°C下，上述聚合物都不是可生物降解和弹性体（橡胶样）。
在我们开发心血管原位TE应用材料的方法中，我们选择了合成的热塑性弹性体（TPEs）进行详细的探索。这些材料相对柔软，众所周知，它们在承受应变和压力的同时保持其形状，这是大多数心血管组织共同的和需要的特征。由于这些聚合物的合成性质，它们的性质可以被调整以满足特定的要求。在本成像研究中，我们选择了PCL-U4U作为基础生物材料，这是一种先前报道的具有交替聚己内酯（PCL）软块的聚酯，以及其大分子结构中的丁二脲（U4U）硬块段。
研究发现，PCL-U4U是一种弹性体、半结晶、非细胞毒性、生物降解材料，可以通过静电纺丝加工实现高多孔支架。[4]此外，我们设计并制备了一种新型的CTCA，其结构具有相同的丁烯二尿素基：I-U4U材料（见图1和支持信息）。匹配的U4U双尿素基团之间的强氢键相互作用将CTCA非共价结合到PCL-U4U碱基生物材料中，从而创造了一种超分子和模块化不透光的生物材料。
我们在早期的工作中采用了这种模块化的方法，在这些工作中，通过将碱基生物材料与多肽结合，增加功能的生物材料被开发出来，这两种成分都包含超分子相互作用的双脲（U4U）或尿嘧啶（UPy）基序。注意，将双尿素成分与不匹配的超分子基序混合已被证明是对模块化材料中的成分的次优锚定（另见支持信息）。在另一个例子中，我们创建了模块化和超分子超水凝胶，可以用MRI成像。
最后，结合和相关这项工作，我们密切检查PCL-U4U生物材料，特别是关于特性和机械测试静电纺网体外降解后暴露于酶和氧化物种，体外巨噬细胞作用于支架网格，和体内使用静电纺支架。这些研究证实了这种合成材料的非细胞毒性和弹性体特性。
图1图1：本研究的示意图。以聚己内酯为基础的弹性生物材料PCL-U4U和造影剂I-U4U通过双尿素（U4U）单位（蓝色盒子）之间的超分子氢键相互作用，从而将碘化物种（紫色圆圈）纳入模块化不透光的生物材料中。简单地在溶液中以所需的比例混合，然后静电纺丝可以产生小口径血管移植物（图）。将原位TE支架作为主动脉介入移植物植入大鼠，用CT及时监测，无创观察其降解情况
在本研究中，我们通过静电纺丝PCL-U4U弹性体生物材料和新引入的I-U4UCTCA制备了不透射线的支架（图1）。利用扫描电镜（SEM）和差示扫描量热法（DSC）对制备的多孔支架进行了支架的形貌和研究材料形态。支架作为大鼠主动脉插入物植入（n=24），试验组动物接受PCL-U0-U和U-U4U的移植，对照组仅接受PCL-U4U的移植（两组n=12）。在三个时间点（1天、14天、1个月；所有时间点n=4）。合成植入物的降解已通过CT扫描进行无创监测，而移植物的移植物允许通过GPC研究支架的降解。两组的外植体也通过（免疫）组织化学检查，以研究在植入期间发生的新组织形成。
二、实验部分
2.1：I-U4U造影剂和PCL-U4U弹性体
I-U4U造影剂的合成和表征在支持信息部分有充分的描述。关于PCL-U4U弹性生物材料及其制备的细节可以找到，以及用于表征PCL-U4U的方法（支持信息）。
2.2：静电纺丝制备主动脉移植移植
采用静电纺丝法制备了三种总碘物含量分别为0、11.4和15.2w%的支架移植物。
2.2.1：静电纺丝的解决方案
第一溶液将PCL-U4U浓度为12.5wt%的氯仿/甲醇（1wt%甲醇）溶解，而第二溶液PCL-U4U和I-U-U4U分别溶解在12.5和4.8wt%的相同溶剂混合物中。第三种溶液在PCL-U4U中为12.5wt%，在I-U4U中为7.wt%。这些重量百分比是每重量溶液的材料重量。
2.2.2：脚手架移植物的制作
将三种溶液（见上文）密封在容器中，在室温下磁性搅拌4小时，以确保PCL-U4U与I-U4U的均匀溶解。接下来，通过聚合物溶液的静电纺丝（使用IME技术公司的静电纺丝设备）制备支架。将静电纺丝纤维收集在一个直径为2.1mm的旋转圆柱形心轴目标上，形成一个高度多孔的圆柱形物体（管）。所有实验的流速均为25μLmin?1。溶液通过一个水平固定的喷嘴驱动，并朝向固定在10厘米距离上的接地旋转圆柱形集热器。喷嘴与目标之间的电位差为14kV。在纺丝过程中，温度和湿度分别保持在2°C和0%不变。最后，将制备好的试管从心轴上取下，切入可用于植入的支架中。用70%乙醇喷涂处理，然后晾干。
2.：电纺丝支架的表征
2..1：DSC
使用TAQ-机器，用DSC分析碘化物含量分别为0、11.4和15.2重量%的静电纺丝支架样品，以及整齐的I-U4U样品。熔化转变（Tm）评估在第一次加热运行（10°Cmin?1），并通过其温度峰值报告，而玻璃化转变（Tg）记录在第二次加热运行（40°Cmin?1）。
2..2：SEM
采用扫描电镜（QuantaF）观察了碘含量分别为0和11.4%的支架的多孔结构。获得支架灭菌前后的扫描电镜图像。在扫描电镜分析之前，样品被安装在一个支架上，并使用克雷斯辛顿溅射镀膜机用金进行溅射。使用2kV光束在不同的放大倍数下拍摄扫描电镜图像。用ImageJ软件对获得的图像进行分析，以评估静电纺丝纤维的直径和试管的壁厚。
2..：孔隙度
我们可以准确地称重多个支架样本，并通过使用数字卡尺测量支架的外径和长度来评估这些电纺丝支架的体积。支架的内径等于心轴的大小（2.1mm）。假设PCL-U4U（PCL本身的密度为1.15gmL?1）为?1，I-U4U的密度为1.5gmL散装材料的?1。I-U4U的密度估计是基于I-U4U的相对分子量（即Da），以及一个相应的和假设的分子有一个甲基和两个乙基，而不是三个碘化基（即Da，即与I-U4U相似的分子体积）。最后，估计该假设分子的密度为1.02gmL?1（二环己基尿素的密度为1.02gmL?1）。给定测量到的支架的重量和体积，以及估计的材料的密度，我们可以（大致）计算出支架的孔隙率。
2..4：水暴露性泄漏试验
将碘化物含量为15.2wt%的电纺丝支架样品浸泡在室温水中（5mg样品，5mL水中）中，长时间孵育。在几个时间点（0、2、4、8、16、6、72和天），将材料样品干燥，用二甲基甲酰胺（DMF）作为内标（VarianMHzNMR）的1HNMR测量。样品还采用凝胶渗透色谱分析（Varian/聚合物实验室PL-GPC50，配备ShodexGPCKD-柱，使用含有0.1%溴化锂的DMF作为洗脱液，在50°C下操作）。实验结束时，用高效液相色谱光相二极管阵列质谱（HPLC-PDA/MS）检测上清水，该设备是岛津LC-10ADVP系列LC，与PDA探测器（芬尼根测量员PDAPlus探测器，热电子公司）和离子阱探测器（LCQFleet，热科学公司）相结合。分析在K下使用AlltechAlltimaHPC18μ柱，注入体积为2μL，流速为0.2mLmin?1，水梯度为MeCN（从5%到%MeCN，其中MeCN和水均含有0.1%甲酸）。
2..5.细胞毒性试验
电纺丝支架（0、11.4和15.2wt%）加入完全培养基（GibcoDMEM，添加10v/v%胎牛血清和1v/v%PenStrep），温度为7°C和5%二氧化碳。样品以每体积比20mg支架/毫升完全培养基提取24小时。将T小鼠成纤维细胞以每孔5×10细胞的密度接种在96孔板中，并在标准培养条件下保持24小时，直到细胞生长到50%的融合度。接下来，移除培养基，将T成纤维细胞在μL过滤提取物的存在下再培养24小时。细胞暴露于含有1v/v%Triton-X的完全培养基中，作为细胞毒性条件的内部对照。使用MTT细胞毒性测定法测定其细胞毒性。
简单地说，噻唑蓝四溴铵（MTT）（来自Sigma）溶解在磷酸盐缓冲盐水中，浓度为5mgmL?1，过滤并在完全培养基中进一步稀释至最终浓度为1mgmL?1。取提取液培养基，取50μLMTT/培养基。成纤维细胞在标准培养条件下孵育2小时，然后取出MTT溶液，用μL的异丙醇（用0.04m盐酸酸化）替换，直到所有的甲瓒晶体溶解。随后，在TecanSafire酶标仪上在nm（nm参考波长）下测定吸光度。在研究过程中，细胞活力相对于在未经处理的培养基中保持的T成纤维细胞，该参考细胞被设置为%的细胞活力。
2.4：电纺丝支架的植入和移植
2.4.1：动物
荷兰乌得勒支大学的动物护理和使用委员会批准了所有程序。24只健康雄性斯普拉格道利大鼠（00-克），购自查尔斯河实验室，分成组饲养，并随意喂食。环境在室温下保持24h，光-暗周期为12-12h。大鼠分为两组，试验组（n=12）接受PCL-U4U和I-U4U（碘化物含量11.4wt%）主动脉间置移植物，对照组（n=12）接受仅PCL-U4U（碘化物含量0wt%）主动脉间置移植物。所有24个移植物都用戈尔-特克斯盾牌包裹着。移植物在第1天（=8）、第14天（=8）和第1个月后（=8）移植。
2.4.2：植入式移植物的准备
为了防止细胞跨壁和经吻合口生长，所有移植物均采用Gore-Tex保护。采用间断缝合线（10-0ethelon，静电纺管远端和近端BV-4），对其进行端到端吻合。此外，Gore-Tex被包裹在静电纺丝管上，形成了一个无法穿透的外层（图4）。
2.4.：外科手术
动物用异氟烷气体麻醉。行中线剖腹手术，腹部脏器侧化以暴露下腔静脉和腹主动脉。主动脉与下腔静脉分离后，用微血管夹封闭肾动脉与主动脉分叉之间的腹主动脉段。主动脉横断后，支架，包括Gore-tex条，使用间断缝合进行近端和远端端端吻合（10-0Ethilon，BV-4）。取出血管夹后，确认主动脉远处的脉动血流。所有支架均立即暴露于动脉血流动力学条件下。腹部被封闭成两层（-0VicrylFS-2）。术中及术后均未使用肝素。丁丙诺啡作为术后腹腔注射镇痛药。在老鼠回到笼子之前，它们被评估为急性移植物血栓形成或后肢瘫痪的证据。
2.4.4：终止和外植
在终止前，动物使用KXAmix麻醉，包括氯胺酮/盐酸（奈酮，毫克毫升?1），噻嗪（塞达蒙，20mg毫升?1）和阿托品（阿托品酸PCH，1mg毫升?1）。大鼠腹腔注射0.2mL/gKXAmix。在左颈静脉或尾静脉引入阿布卡特，以便在CT扫描时使用非离子性血池造影剂。CT扫描后（见下文），小心移植移植物。外植体在4%福尔马林固定中进行免疫组化。用于后续GPC分析的外植体用未稀释的高乐氏溶液（5.25%次氯酸钠次氯酸鈉水溶液）处理20min，这足以去除整合组织。然后，这些外植体用磷酸盐缓冲盐水冲洗（PBS），然后晾干以作进一步分析。
2.4.5.GPC
将PCL-U4U参考物以及从高乐氏处理的外植体中回收的合成材料（每个样品≈0.5-1mg）溶解在含0.1%溴化锂的0.75mLDMF中。溶液通过0.2μm注射器过滤器过滤，并在50°C的瓦里安/聚合物实验室PL-GPC50上重复分析（两次单独注射），配备ShodexGPCKD-柱，并使用带有0.1%溴化锂的DMF作为洗脱液。据此，测定了相对于PEG标准的平均数量（Mn）和平均重量（Mw）以及分子量分布（多分散性D=Mw/Mn）。给出了单个动物的Mw值的标准偏差（从重复的测量值中）。还给出了每个时间点的平均Mw值，包括这些平均值上的标准差。
2.5.CT扫描
2.5.1.程序
CT采集在层CT扫描仪上进行，（iCT，飞利浦医疗保健，荷兰）。扫描范围包括了该动物的整个身体。暴露参数为kV管电压和mAs有效管电流。首先，成像时不使用动脉造影剂。随后，所有动物通过左颈静脉或尾静脉以0.2mL?1（超静脉00mgmL?1，碘普胺，美国拜耳医疗公司）注射碘非离子造影剂。用动脉造影剂增强的图像来评估移植物的通畅程度。图像采集在延迟8或15秒后开始。图像以0.9mm切片厚度重建0.45mm，并转移到专用工作站。
2.5.2.体积和长度的测量值
利用非对比度增强图像，计算了使用I-U4U移植物的PCL-U4U的体积和长度。第一个D体渲染图像是使用自定义图像滤波器生成的，该滤波器包含了Hounsfield单元（HU）值高于HU的所有体素。使用电子工具，移植物被数字化切除并测量其体积。
2.5..密度测量
在标准的非对比增强轴向图像上，在移植物外边界后的一个圆形感兴趣区域（ROI）被放置在移植物的近端、中间和远端三个水平。测量了ROI中的平均信号强度和信号强度的标准差。
2.6.组织学
2.6.1.免疫组化
外植体在4%福尔马林中固定，1%琼脂（欧金特）预包埋，然后石蜡包埋。连续4个μm切片用苏木精和伊红（HE）染色为基本形态，用小天狼星红（PSR）染色胶原蛋白的检测。使用单克隆小鼠抗cd68抗体（Serotec，MCA41GA，1：）在柠檬酸缓冲液中提取抗原后，进行免疫组化染色检测巨噬细胞。
2.6.2.定量组织学和免疫组织学分析
两名研究人员对被调查组和解释的时间点不知情，他们独立进行了分析。切片用尼康E显微镜和ACT-1软件进行拍照。为了测量平均壁厚和平均管腔直径，每个载玻片都在2×物镜下进行研究。在高功率放大镜下（高功率场（hpf），40×物镜下研究了细胞的数量；面积为0.04mm2）。使用ImageJ软件手动计数每个PCL-U4U管（含或不含I-U4U）中4个随机hpf区域的细胞总数。
用PSR染色法和圆偏振光法定量测定胶原蛋白的含量。每个染色切片，对4个随机的hpf场进行数字化拍照，标记胶原阳性区域并进行标记和二值化。阳性面积是以占总表面的百分比来测量的。在4个随机hpf场下，对每个染色载玻片的免疫阳性细胞（CD68）进行定量分析。在4个hpf图像中测量阳性细胞的面积从二值化图像中得到的总数的百分比。然后计算每个样本的四幅高功率图像的平均值。
2.7.统计分析
数值数据以平均±标准差表示。统计学差异采用Prism或Mann-Whitney软件)。采用Kruskal-Wallis检验来测量支架密度的统计学差异。p值为0.05，视为差异有统计学意义。采用线性回归分析来比较斜率。
三、结果和讨论
.1.I-U4U造影剂的合成及材料表征
方案1方案1：造影剂I-U4U的合成。试剂和溶剂：i）氯仿、乙腈；ii)氯氧烷、DMF、二氯甲烷；iii)氯仿、吡啶；iv)二叔丁酯、DIPEA、异丙醇；v)2、二氯甲烷；vi)TFA、二氯甲烷；vii)1、DIPEA、二氯甲烷。
以外消旋2-乙基1-己胺与二异氰酸丁酯反应合成I-U4U双尿素CA，制备分离得到的单尿素中间体1（方案1）。活化的构建块2由2、、5-三碘苯甲酸按照报道的程序分两步制备。环氨基和支链氨基，实际上是异构体的混合物，被胺保护一个boc基，然后连接到苯甲酰吡啶2，制备酯构建块5，柱层析后分离，产率为65%。在二氯甲烷中使用TFA对Boc基团进行脱保护，得到TFA-盐产物6，并与异氰酸酯1偶联，得到CT-CA最终产物I-U4U。纯化后分离得到I-U4U，收率为5%。I-U4U可良好地溶于有机溶剂，如氯仿。
成功制备了PCL-U4U材料基材，NMR数据与文献、相匹配，记录的分子量足够高（Mw=6.4kDa，Mn=1.7kDa；D=2.0）。散装材料显示类似的力学性能报道，拉伸测试铸造电影给一个年轻的模量E=15.9±0.4MPa，一个强度断裂（和美国）σ-breat=27±MPa，应变断裂ε-break=1±98%和拉伸韧性UT=±21MPa。
.2.电纺丝支架的制备与表征
将造影剂I-U4U加入PCL-U4U生物材料中，将这两种成分与随后的静电纺丝混合，制备不透明的血管移植物。同时也制备了不含I-U4U的参考PCL-U4U移植物。制备内径与大鼠固有主动脉相匹配的移植物（2.1mm）。支架材料的设计和制作的含量分别为0、27.7和6.9wt%I-U4U，分别对应于碘含量为0、11.4和15.2wt%的支架移植物。因此，两种模块化生物材料中I-U4U和PCL-U4U的双尿素基团的摩尔比分别为≈1：1和≈8：5。
图2图2：用氯仿/甲醇(1wt%甲醇）电纺丝的支架的扫描电镜图像。所有的图片都显示了脚手架管的外表面。A、B)不含碘化物的参考PCL-U4U移植物，C、D)碘化的PCL-U4U/I-U4U移植物，A、C)和B、D)在乙醇/水消毒后。白色条的全长分别代表μm（用于概述）和μm（用于插图）
通过扫描电镜测定，支架的壁厚在0.±0.1mm范围内。利用扫描电镜研究了静电纺丝支架中的纤维结构和取向。图2显示了脚手架的外表面。支架是多孔的，PCL-U4U参考材料显示出更均匀的纤维结构和开放空间，簇状纤维的数量少于碘化的PCL-U4U/I-U4U材料。对于参考支架和碘化支架，与外表面的纤维相比，移植物内表面的纤维表现出更平坦的外观（图中没有）。参考PCL-U4U支架的平均纤维直径为4.5±0.5μm，而含有11.4%碘化物的电纺丝PCL-U4U移植物的平均纤维直径为4±1μm（表1）。灭菌作用不影响整体结构。计算出0、11.4和15.2%的支架的孔隙率分别为65%、62%和66%。
表1表1：编制的静电纺丝条件和结果。
采用DSC方法进行热分析，研究了模块化材料的形貌。参考PCL-U4U支架在54°C（ΔH=1.2Jg?1）出现一个弱而广泛的熔化转变，在U4U双尿素聚集体的°C（ΔH=11.6Jg?1）出现另一个广泛的熔化转变。在?56处记录了°C的玻璃化转变。PCL-11.4和15.2wt%碘化物的U4U/I-U4U碘化生物材料支架分别在54°C（ΔH=1.0Jg?1）和56°C（ΔH=1.4Jg?1）显示宽弱熔体，分别在°C（ΔH=9.1Jg?1）和°C（ΔH=6.5J=6.5Jg?1）和?56和?57°C的熔化转变。在5°C（ΔH=4.0Jg?1）条件下，整齐而固体的I-U4U造影剂本身表现出微弱而广泛的熔化转变。
在室温下，在碘化物含量最高（15.2wt%含量）的水中培养，持续天，通过对干燥支架样品的1HNMR分析，没有改变材料的组成。PCL-U4U材料的分子量在天的测试期间也保持不变。根据HPLC-PDA/MS的评估，暴露在碘化支架中的水长期保持透明，不包含任何可以追溯到PCL-U4U或I-U4U的溶质。
图图：使用MTT法测定细胞存活率，其中T成纤维细胞与1)PCL-U4U、2)PCL-U4U/I-U4U（11.4%）和)PCL-U4U/U4U/U-U4U培养后，暴露于完全培养基中。细胞活力相对于在未处理培养基中（参考空白B）观察到的成纤维细胞的细胞存活，并设置为%。暴露于Triton-X表面活性剂已被用作进一步的对照(C).
使用T成纤维细胞的MTT检测表明，所研究的支架移植物都没有显示出细胞毒性作用（图）。特别是，添加I-U4U，无论是11.4或15.2重量%，都没有对观察到的细胞活力产生不利影响。
..植入物和CT扫描
图4图4：外科手术过程的示意图。从左到右：腹主动脉（红色）脱离下腔静脉（蓝色）；血管夹闭塞后，腹主动脉横切；植入由不可穿透的GoreTex和电纺丝PCL-U4U，无论有无I-U4U；拆除血管夹，在移植物周围包裹GoreTex片。这种动物模型仅仅是用来诱导血液中循环细胞的生长，从而模拟了人类的情况。[
选择碘化物含量最低，为11.4wt%的碘化支架进行植入（图4）。在24只动物中，有2只动物因术中在goretex-电纺丝管吻合口附近出血而未能存活。平均手术时间分别为1h和26min，平均血管钳夹时间为9min。22只存活动物未发生术后并发症，无感染或后肢瘫痪的迹象。
图5图5：大鼠植入后1天的CT图像。A)概述；由PCL-U4U和I-U4U（11.4%碘化物）组成的主动脉介入移植物。B，C)对照PCL-U4U移植，D，E)检测PCL-U4U/I4U-U4U移植，B，D)动脉CT注射前，E)动脉CT造影剂（iopromide，“Ultravist”）。条形图表示2厘米。
11.4%碘化移植物在CT图像上清晰可见。在第1天，出现了一个高密度的信号（图5A、D、E）。移植物的平均长度为6.4mm，平均直径为.6mm。电纺丝管近端和远端的Goretex和包裹在整个移植物的Goretex不能在CT图像上进行评估。由于PCL-U4U与软组织的放射不透明相似，没有碘化物的对照移植物在CT图像上不可见（图5B），只能通过增强扫描评估其管腔（图5C）。所有的移植物都是通畅的（图5C、E）。
图6图6：主动脉夹层植入物随时间变化的CT图像、体积和密度。=)1天，B)14天，C)植入后0天的轴向图像。D)在CT图像上测量的体积显示，相对于t=0,0天后显著下降（p=0.05）。=)移植物1天、14天和0天t=以及移植物近端（=）、中端（=）和远端(D)切片轴向图像测量的密度。植入后第14天的标准差较宽，表明密度更不均匀。
及时记录的轴向CT图像清楚地显示对比度消失了（图6A-C），特别是在第1天与第0天的图像进行比较时。冠状面CT图像证实了这一观察结果（支持信息）。植入移植物的CT造影剂体积随时间显著下降（图6D），因为植入前碘化移植物的体积为6.01mm，而在第0天记录的体积为2.56mm±1.67mm（p=0.05）。中间点似乎显示平均值下降（5.16毫米±1.9毫米1天，和4.毫米±1.1毫米14天），支架的CT对比密度量化测量胡轴向图像（图6E），随着时间的推移，不均匀的密度。第0天的平均密度明显低于当天的平均密度1（p0.）和第14天（p0.）。此外，标准差增加，在t=第14天出现的偏差最大。
.4.种植物降解分析
表2表2：通过对从外植体中回收的PCL-U4U材料的GPC分析，确定的重量平均分子量（Mw）。值以kDa表示。所有样品的分散性D（Mw/Mn）的偏差很小，其值在1.8和2.4之间（数据未显示）。当没有回收用于GPC分析的材料（n.m.），当动物死亡时（-），当由于回收的材料太少而进行1次而不是2次GPC测量时（*）。第0天为植入前PCL-U4U的Mw。
通过GPC对从外植体中提取的PCL-U4U材料进行分析，记录其分子量（表2），从而评估PCL-U4U在植入过程中是否降解。在许多病例中，特别是对于已经植入了0天的外植体，合成的植入材料已经完全降解，因为没有任何材料无法追踪。在这些情况下，显然，不能进行GPC分析。1天后，8个外植体样本中有8个给出了可分析的回收材料，而14天后，6个外植体样本中有5个，0天后，（只有）8个外植体中的个给出了一些回收的合成材料进行分析。从表2中有限的分子量数据来看，PCL-U4U材料的分子量似乎及时降低。
.5.（免疫学）组织化学分析
图7图7：在第1、14和0天移植的碘化和对照移植物的组织学检查。应用于HE染色，巨噬细胞为CD68，PSR为胶原蛋白。黑条表示00μm（第一行HE）、20μm（第二行HE和CD68）和50μm（PSR）。支持信息以放大的格式提供了这些图片。
移植的移植物没有显示狭窄或血栓形成（图7，HE染色）。植入后一个月，移植物出现扩张。平均直径随时间增加，为2.09±0.09mm和I-U4U试验组和非I-U4U对照组分别为2.20天和2.56±0.46mm，14天和2.8±0.47毫米和2.81±和2.88±0.2Umm。植入物的壁厚支架没有随时间而变化。第1天，试验组和对照组的壁厚分别为0.29mm±0.0mm和0.27±0.0mm。在第14天，试验组观察到厚度为0.21±0.06mm，对照组观察到厚度为0.26±0.07mm。最后，0天后，试验组测量细胞壁厚为0.22±0.04mm，对照组为0.21±0.05mm。如上所述，随着时间的推移，两组种植体的尺寸以相同的方式改变。此外，在对照组和试验组中，细胞在植入后立即渗透并扩散，并覆盖了移植物的整个厚度。第1天，有限数量的细胞浸润移植物（试验组每hpf10±12个细胞，对照组每hpf2个±1个细胞）（图7，HE染色第二行；图8A）。
图8图8比较碘试验移植物和无CA对照移植物的组织学结果。A)每个hpf测量的不同时间点的细胞数量。B)区分数CD68阳性细胞随时间的变化。0天后用胶原蛋白测量来定量C)基质形成。
实验组在第14天增加到每hpf60±12个细胞，在第0天增加到每hpf90±20个细胞。在对照组中，在第14天增加到每hpf9±19个细胞，在第0天每hpf11±22个细胞。在0天以上，试验组（p=0.0）和对照组（p=0.0）的细胞数量均显著增加。测试组与对照组相比的细胞数量在14天的时间点似乎略低，但实际上在每个时间点并没有显著差异（图8A）。
第1天，细胞浸润主要由中性粒细胞组成。在第二个愈合阶段，CD68阳性细胞（巨噬细胞）浸润移植物（图7，CD68染色；图8B)。在第1天，试验组的阳性面积分数为0.0%±0.0%，而对照组为0.17%±0.02%。在第14天，试验组的面积分数为1.51%±0.57%，而对照组为0.88%±0.6%。在试验组第0天，对照组，该区域进一步增加到2.76%±1.41%和2.02%±0.75%。从第1天到第0天，试验组和对照组的CD68阳性细胞均显著增加（两组的p=均为0.02）。在所有时间点，测试组的面积分数没有显著差异（图8B）。
两组在第0天产生的胶原表面相似，试验组的面积分数为1.26%±1.0%，而对照组的面积分数为1.15%±0.6%（p=0.85）（图7，PSR染色；图8C）。
组织学数据证明，植入的合成材料在体内会及时降解。特别是，组织学图片显示了所有面板中大小不均匀的白色区域（图7，HE和CD68染色）。这些白色区域表示合成材料，[5]在这种情况下，PCL-U4U添加或不添加I-U4UCA。显然，植入0外植天后，外植体的白色区域比其他外植体小，数量也少得多。
.6.讨论
我们开发了一种新的ct成像造影剂I-U4U，其碘化物含量为41w%，可用于监测原位组织工程中使用的心血管替代物的降解。I-U4U用酯基团装饰，以增加其在体内降解的可能性在U4U双尿素基团两侧的分支基团，使其可溶于有机溶剂，使其从溶液中加工，特别是用于静电纺丝的目的。I-U4U可以简单地与PCL-U4U混合和处理，以创建一个超分子和模块化的不透光的生物材料。PCL-U4U组件是一种弹性和坚韧的材料（E=16MPa；UT=MPa；ε-break=0%的散装材料），这种类型的软材料可以考虑用于心血管TE，作为经常应用的硬、脆和非弹性聚酯材料，如PCL、PGA或PLA。例如和比较，静电纺丝PCL经常用于TE，作为一种散装材料，它的e模量为-MPa，ε-break为≈80%。
这些高模量与包括人类在内的各种哺乳动物的血管组织并不一致，因为这些e模量在0.1到5MPa的范围内。人类动脉所承受的[50]菌株通常为10%-15%。根据这些数据，静电纺丝PCL-U4U网格在5%至15%的应变下显示出相当匹配的0.5~2MPa的e模量。
利用DSC对模块化PCL-U4U/IU4U材料的形貌进行了检测，结果表明，这两种成分在分段热塑性弹性体（TPE）材料的U4U硬相中紧密混合。这可以从观察到，硬相中U4U堆栈的熔化转变从PCL-U4U的°C变化到添加了I-U4U的PCL-U4U的°C。显然，这两个组分的U4U单元相互作用，共同形成一个异构的U4U硬相。相比之下，Tg在加入I-U4U时没有变化，因为它保持在≈?56°C，这表明I-U4U材料没有混合到PCL非晶软相中。
在一项基于PCL1-U4U的类似模块化TPE材料和一个具有2-乙基己基两侧的超分子填基组分的形态学研究中，也报道了类似的发现。对于这些模块化材料，U4U硬相显示由直径为5nm的纳米纤维组成，表明U4U基团沿着这些纤维混合。本研究还表明，u4u填料含量高达60mol%的模块化材料的e模量稍高，但重要的是，保留了弹性性能。
我们选择了PCL-U4U/I-U4U支架，研究碘含量最低，为11.4w%，用于体内成像和植入研究。首先，由于已经评估，在碘化物含量至少为-5wt%的[]值下，并考虑到制备的静电纺丝支架的孔隙率（≈60-65%），11.4重量%的支架应该适用于≈含量为4.0-4.6w/v%。第二，初步的CT成像测试显示，碘化物含量为11.4wt%的支架确实清晰可见。
在PCL-U4U中添加I-U4U并不影响静电纺丝材料的细胞毒性，似乎也没有改变材料基质内的细胞行为。我们的结果表明，实验组（PCL-U4U添加I-U4U）和对照组（仅PCL-U4U）的静电纺丝移植物对成纤维细胞无细胞毒性，在体内在细胞粘附、浸润和分化方面具有相似的趋势。当考虑到完整的0天的植入实验期间时，数据最具可比性，而在14天后出现了一些偏差（尽管不显著）。此外，这些电纺丝基质中的胶原蛋白产量是可比较的。
在试验组和对照组，细胞数量和胶原蛋白数量随着时间的增加而增加。HE染色切片上的大体形态显示中性粒细胞最初粘附，随后巨噬细胞流入（经CD68染色证实）。随着时间的推移，出现了更多的肌成纤维细胞，随后在一个月后就产生了胶原蛋白，PSR染色证实了这一点。这些结果与其他原位TE研究的组织学结果相比较，这些研究研究了生物可降解合成移植物的定植和随后的重塑。
对于我们的血管植入物，实验组和对照组的移植物壁厚没有差异。两组患者的移植物直径都有增加的趋势，这意味着移植物没有保持原来的形状，并有扩张。
PCL-U4U/I-U4U试验组可通过CT扫描对体内支架降解进行无创成像和监测。从第1天到第0天，成像体积和密度均显著下降，而密度从均匀信号变为不均匀信号。因此，I-U4U材料在植入部位消失，并在0天内被侵蚀和/或降解。然而，本研究并没有具体研究I-U4U材料的最终命运。显然，参考PCL-U4U移植物未见，模块化PCL-U4U/I-U4U植入物仅注册含有碘原子的材料。因此，我们也通过检查从外植体样本中回收的合成材料来评估支架的降解情况。在这里观察到，植入1天后，所有外植体样本都含有合成的PCL-U4U材料用于GPC分析，而植入0天后，大多数外植体没有追踪合成支架材料。
此外，GPC显示PCL-U4U的分子量下降，组织学分析显示，随着时间的推移，合成植入物片段较少且更小。这些支架降解结果在定性上与观察到的CT成像信号的时间下降相一致：CT对比度的丢失与外植体中PCL-U4U材料的丢失相一致。显然，I-U4U和PCL-U4U会共同降解和/或共同侵蚀（另请参见支持信息）。演示一个精确的定量相关性之间的支架体积和密度CT图像一方面和支架退化，然而，从而调查如果PCL-U4U和I-U4U侵蚀和降解（完全）相同的速度，研究涉及更多的动物或研究涉及更大的移植使用更大的动物模型应该执行。
本研究表明，PCL-U4U作为一种多孔血管移植物的降解，即在血液的持续存在和菌株的持续作用下，在大约1个月的时间框架内快速发生。相比之下，当PCL-U4U作为大鼠皮下植入物进行研究时，该材料存在的时间更长，至少到最后一个研究的时间点（42天），尽管植入物是固体薄膜（μm），而不是多孔膜。[4]当使用多孔结构进行心血管体内TE时，可能最好使用比PCL-U4U降解更慢的材料，允许新组织形成更多的时间和成熟。因此，在一项关于心脏瓣膜TE的研究中，我们使用了PC-BU，这是一种类似于PCL-U4U的序列控制材料，尽管是聚己基碳酸酯而不是pcl酯软块。
最后，请注意的是，我们的研究结果是通过一个动物模型获得的，该模型只允许细胞从血液中渗透到多孔的植入物中，从而模拟人类的情况。为此目的，已经使用了Goretex表。据推测，Goretex将不适用于临床环境。
四、结论
我们的结果表明，电纺丝和植入PCL-U4U血管移植物，并模块化添加I-U4U造影剂，在CT图像上清晰可见。移植物的体积和密度可以方便地测量和监测。与支架降解相一致，CT信号下降。从更一般的意义上说，本研究表明，创新的不生物可降解透光材料可以通过基础生物材料与CT造影剂模块组合设计和制备，这两种成分都含有强相互作用的超分子匹配基序，如U4U基团。超分子相互作用导致生物材料与紧密混合和适当锚定的成分，在体内可以共同侵蚀和共同降解。因此，成像不仅将报告CA，而且还将报告整个退化的植入物。
因此，与目前用于CT成像的固体植入材料相比，这种超分子和模块化方法可应用于开发替代的、可能改进的不透光（生物）材料，如材料/金属或材料/盐混合物（通常不均匀和/或不可生物降解），或通过后改性或封盖程序获得的材料（通常具有较少控制的分子结构和/或牺牲材料性能）。综上所述，以模块化和超分子的方式创建固体不透光生物材料的概念可以用于无创监测和成像合成植入物的生物降解。
编辑
富临塑胶